Первоначально найденный как часть иммунной системы Стрептококка pyogenes бактерии, CRISPR связал белок 9 (CAS9), в его родном государстве, признает иностранные последовательности ДНК и калечит их.У бактерий система используется, чтобы предназначаться для иностранной вирусной ДНК от бактериофагов – ДНК, которую это уже признало врагом через ее эволюционную историю и включило отчет его в ее собственную ДНК.CRISPR (Группируемый регулярно делал интервалы в коротких палиндромных повторениях, высказался, «контейнер для овощей») представляют сегменты ДНК, которые содержат короткие повторения последовательностей оснований, сопровождаемых короткими сегментами «ДНК распорной детали», полученной от предыдущих воздействий до иностранной ДНК.
Комплекс состоит из белков, которые распутывают ДНК, другие, которые сокращают двойную спираль в определенном местоположении и РНК руководства, которая может признать вражескую ДНК в клетке.Исследователи, изучающие эту древнюю иммунную систему, поняли, что, изменяя последовательность РНК руководства, чтобы соответствовать данной цели, она могла использоваться, чтобы разрезать не только вирусную ДНК, но и любую последовательность ДНК в точно выбранном местоположении.
Кроме того, новые разделы ДНК могли быть введены, чтобы соединить с недавно разделы сокращения.Метод был сначала задуман и разработан Дженнифер Дудной (Калифорнийский университет, Беркли) и Эмманюэль Шарпантье (Университет Умеа) и использовался в культивируемых клетках – включая Стволовые клетки – и в оплодотворенных яйцеклетках, чтобы создать трансгенных животных с целенаправленными мутациями, которые помогают изучить генетические функции.
CRISPR/Cas9 может затронуть много генов сразу, допуская лечение болезней, которые включают взаимодействие многих генов.Метод улучшается быстро и ожидается к одному дню, имеют применения в фундаментальном исследовании, разработке лекарственного средства, сельском хозяйстве и лечении человеческих пациентов с генетическими заболеваниями.Однако создание предназначалось для мутаций CRISPR/Cas9, в настоящее время дорогое и отнимающий много времени, особенно для крупномасштабных исследований.
Процесс также подвержен ошибкам, ограничивая его широкое использование. Эта проблемная основа, частично, от отсутствия полного понимания того, как CRISPR/Cas9 работает на молекулярном уровне.В ноябре исследовательская группа из Университета Северного Техаса (UNT) во главе с Цзинь Лю использовала Независимый суперкомпьютер в Texas Advanced Computing Center (TACC), чтобы выполнить первый все-атом молекулярные моделирования динамики Cas9-катализируемого раскола ДНК в действии.
Моделирования, сообщил по своей природе о Научных Отчетах, пролитом свете на процесс редактирования генома Cas9. Они также помогли решить споры об определенных аспектах сокращения: такой как, где точно редактировать происходят и производит ли Cas9 законченные тупым образом или ступенчато законченные разрывы с выступами в ДНК.«Прямо сейчас есть довольно много проблем в том, как мы используем это в терапевтических применениях.
Специфика и эффективность фермента не высоки», сказал Лю. «Также трудно поставить фермент положению генного редактирования. Чтобы решить эти проблемы, во-первых, мы должны знать, как этот фермент работает.
Наше исследование обеспечивает основу понимания механизма Cas9».Ученые ранее определили структуру Cas9 в ее бездействующем государстве через кристаллографию рентгена, но генный процесс редактирования происходит настолько быстро, что никакая экспериментальная техника не могла захватить свои государственные изменения и определить точно, как это работает.
Используя молекулярные моделирования динамики – метод изучения динамики молекул, моделируя взаимодействия большие количества атомов за установленное время – Лю и соавтор Чжичэн Цзо, также в UNT, смогли наблюдать изменения в ферменте Cas9 в резолюции фемтосекунды и захватить переход к активному государству системы.Моделирования включали Mg2 + ионы, которые, как полагают, вызывают изменения структуры в Cas9, таким образом, это может функционировать.
Исследователи выдвинули гипотезу, что Mg2 + ионы вызывают конформационное изменение активного государства, облегчая близость активных мест Cas9 и ДНК.Моделирования Лю и Цзо работали на Индивидуалисте, охватили 280 000 взаимодействующих атомов. Самая сложная часть, по словам Лю, эффективно пробовала места структуры, чтобы определить местонахождение активного государства.
«Мы старались изо всех сил увеличивать надежность наших результатов моделирования», сказал Лю. «Мы сделали несколько длинных 200 и траектории с 300 наносекундами, и мы также сделали несколько коротких траекторий 60 наносекунд, чтобы гарантировать, что у нас были последовательные результаты. Для каждой конфигурации мы выполнили по крайней мере шесть параллельных моделирований».В дополнение к изучению, как сложные изменения CRISPR/Cas9 в его активное государство, моделирования проливают свет на то, где оно отрезало ДНК.«Обычно люди полагают, что это сокращено в одном положении, но нет никакого явного доказательства, показывающего это», сказал Лю, доцент Фармацевтических Наук в UNT. «Используя наши вычислительные методы, мы решили, что сокращение происходит в другом положении, которое могло означать, что этот фермент мог разрезать ДНК более управляемым способом.
Так, делая эту работу, мы открываем дверь для проектирования более эффективного фермента, который мог разрезать ДНК в более особенном методе».Их заключительный вклад ответил, поразил ли геном, редактируя произведенные тупые концы или концы – нерешенный вопрос с практическими последствиями.
CRISPR/Cas9 сокращает обе половины двухспиральной ДНК. Если бы это сокращается в том же самом положении на обоих берегах, это произвело бы тупые концы; если бы это сокращается в немного отличающемся положении, это создало бы пораженные концы. Их моделирования предположили, что CRISPR/CAS9 создает пораженные концы.
«Это будет довольно очень важно для генного редактирования, потому что ступенчато законченная ДНК более управляема, чем законченная тупым образом ДНК», сказала она.Айок-Хоу Пан, председатель Фармацевтических Наук в UNT, использует CRISPR/Cas9, чтобы провести экспериментальное глазное исследование в его лаборатории. Для обоих его текущих и будущих исследований он видит ценность более ясного понимания поведения фермента.
«Моя лаборатория использовала генную систему редактирования CRISPR/Cas9 для сокрушительного удара новый белок в культивированном зрительном нерве мыши астроглиальные клетки», сказал Пан. «Работа доктора Лю поможет нам понять молекулярное взаимодействие между системой фермента и ее основанием и в конечном счете поможет повысить ее эффективность, которая чрезвычайно полезна для этой замечательной молекулярной техники».В 2015, под покровительством Национальных Академий наук, глобальные ученые объявили, что мораторий на использование CRISPR/Cas9 отредактировал геном человека способами, которые могли быть унаследованы (хотя есть признаки, что исследователи уже сломали этот судебный запрет). Слишком мало они сказали, был известен о процессе и долгосрочных эффектах выполнения так. Но исследование как Лю могло однажды играть роль в точной настройке этих инструментов и создании их выполнимый для человеческого использования.
«Мы пытаемся понять механизм фермента редактирования генома, у которого мог быть большой потенциал к будущим фармацевтическим и терапевтическим применениям, и это могло бы получить нас ближе к позиции, где эта технология могла использоваться на человеческих болезнях», сказал Лю «Без ресурсов TACC, которые это исследование будет невозможно выполнить».