Микробиологи сталкиваются с огромными трудностями в своих поисках, чтобы бороться с устойчивостью к лекарству albican C. и формированием биофильма. Каждый C. albicans микроб является «диплоидным» организмом, поскольку это обычно содержит две копии своего всего генома и всех генов, закодированных в. Однако, чтобы понять роль, которую играет определенный ген, исследователи должны быть в состоянии удалить обе копии в то же время, позволяя им наблюдать эффекты полного отсутствия гена, которое было трудной проблемой в C. albicans. Кроме того, гены часто играют очень похожие и иногда избыточные роли во многих процессах, включая устойчивость к лекарству и формирование биофильма, означая, что больше чем один ген должен быть удален, чтобы определить те гены, функции которых связаны.Чтобы приблизиться к генной проблеме удаления в C. albicans, совместная команда во главе с церковью Джеймса Коллинсэнда Джорджа, двумя Основными Преподавателями в Институте Wyss Гарварда Биологически Вдохновленной Разработки, развивала CRISPR-Cas9-based «генная платформа» двигателя, чтобы создать диплоидные штаммы болезнетворного микроорганизма, у которого могли быть эффективно удалены обе генных копии.
Техника может следовать впереди к лучшему пониманию устойчивости к лекарству и формирующих биофильм механизмов, и посредством будущего исследования, это могло помочь точно определить новые цели препарата и комбинированную терапию. Исследование опубликовано по своей природе Микробиология.
Команда использовала в своих интересах недавно обнаруженную очень редкую «гаплоидную» форму C. albicans, который, как те из других грибов, только содержит один набор хромосом с одной копией каждого гена, но они могут соединяться, чтобы легко создать диплоидную форму. «Мы использовали гаплоид C. albicans напряжения и заменили гены, которые мы хотели устранить с ‘генным двигателем’, который мы ранее разработали и приспособили к определенной биологии C. albicans. После спаривания эти ‘эгоистичные генетические элементы’ продолжают заменять нормальную копию гена в диплоидных грибах», заявили церковь, доктор философии, который является профессором Генетики в Медицинской школе Гарварда и Медицинских наук и Технологии в Гарварде и MIT. «Подход работал так эффективно, что он позволил нам даже удалить пары различных генов одновременно с более высокой пропускной способностью и исследовать, связаны ли их функции».Новый генный подход двигателя основан на системе CRISPR-Cas9, в которой сокращающий ДНК фермент Cas9 предназначен в два региона, которые обрамляют ген в гаплоиде C. albicans грибы двумя так называемыми РНК руководства (gRNAs).
После того, как целенаправленная последовательность генов была исключена, спроектированная генная кассета двигателя, выражающая весь Cas9 и gRNA компоненты, вставлена в его место. Когда два гаплоидных гриба будут соединяться, чтобы сформировать диплоидных потомков, генный двигатель также заменит коллегой гена в другой хромосоме, эффективно удаляя оригинальную версию из организма полностью.Применяя их генный подход удаления, команда смогла определить комбинации генов, которые действуют синергетически в вызове определенным наркотикам, или в вызове формирования биофильма. «Например, удаляя или два гена кодирования насоса утечки CDR1 и CDR2, или TPO3 и CDR2 вместе, предоставленный C. albicans очень чувствительный к fluconazole и другим противогрибковым препаратам, предполагая, что быть планированием два механизма в то же время могло помочь преодолеть устойчивость к лекарству», сказал Ребекка Шапиро, доктор философии, Постдокторант в команде Коллинза. Шапиро объединился с Алехандро Чавесом, доктором философии, как первые соавторы на публикации.
Чавес – бывший Постдокторант, который работал с церковью и Коллинзом; он – теперь доцент в Колумбийском университете Нью-Йорка. «В испытании формирования биофильма мы также нашли, что потеря гена фактора прилипания ALS3 объединяется с потерей нескольких других генов фактора прилипания, которая делает его высоко связанным центром прилипания биофильма и интересного кандидата, чтобы далее исследовать».Исследование предлагает новые нашествия в понимание трудной территории C. albicans патогенез и устойчивость к лекарству. «Мы можем теперь надеть намного лучшую ручку, как генетические сети, которые лежат в основе ядовитости C. albicans, организованы, посмотрите, как они отвечают на экологический определенный и волнения препарата, и таким образом раскрывают новые слабые места, которые в будущем могут привести к новым целям препарата и комбинированной терапии», сказал Коллинз, доктор философии, который также является профессором Termeer Медицинской Разработки & Науки в Массачусетском технологическом институте (MIT) и профессор Биологической Разработки в MIT. «Кроме того, наша генная платформа массива накопителей может быть проектом аналогичных подходов у других грибковых болезнетворных микроорганизмов, таких как недавно появляющаяся Кэндида auris, который является высоко стойким препаратом и был уже отмечен как угроза Центрами по контролю и профилактике заболеваний».
«Это симбиотическое сотрудничество между лидерами способности двух лет Технологических Платформ Предоставления возможности Института Висса, Джима Коллинза и Джорджа Черча, привело к важному новому пониманию биология этого заразного грибкового болезнетворного микроорганизма и как это развивает сопротивление, в дополнение к открытию совершенно нового пути для дизайна более эффективных противогрибковых методов лечения», сказал Директор-основатель Института Висса Дональд Ингбер, Доктор медицины, доктор философии, который является также профессором Джуды Фолкмена Сосудистой Биологии в HMS и Сосудистой Программы Биологии в Бостоне Детская Больница, а также профессор Биоинженерии в МОРЯХ.