Биоимиджинг микроскопией флюоресценции – полезная техника, чтобы изучить локализацию и движение молекул в живых клетках флюоресценцией. Все же постепенное ухудшение флуоресцентных красок, когда выставлено свету высокой интенсивности, необходимому для супер микроскопии резолюции, было главным препятствием для долгосрочных наблюдений.В новом исследовании, опубликованном онлайн в журнале Angewandte Chemie International Edition, команде химиков и биологов в Институте Поддающихся трансформации Биомолекул (ITbM), Нагойский университет развивал новую флуоресцентную краску, «C-Naphox» с расширенной фотостабильностью, чтобы позволить непрерывное живое отображение клетки микроскопией STED, которая открывает двери, чтобы наблюдать биологические события в реальном времени для расширенных периодов времени с высоким разрешением.Достижения в методах суперрезолюции, таких как стимулируемое истощение эмиссии (STED) микроскопия (Нобелевская премия по химии 2014 года) позволили наноразмерную визуализацию биологических систем.
Микроскопия STED позволяет до десяти раз более высокую резолюцию в живых клетках относительно обычных микроскопов, используя луч возбуждения флюоресценции в сочетании с окружающим лучом STED, имеющим форму пончика. В то время как молекулы в центре взволнованы более высокую энергию, указывают и флюоресцируют, молекулы, выставленные лучу STED, ограничены наземным энергетическим государством.Поскольку флюоресценция обнаружена в пункте, который не выставлен лучу STED, это позволяет обнаружить объекты, которые являются только десятками миллимикронов (nm = миллионный из метра) обособленно.
Разрешение обычной оптической микроскопии было ограничено половиной длины волны света т.е. ~200 нм, согласно закону, указанному Эрнестом Абби в 19-м веке. Это вызвано тем, что дифракция легких объектов пятен, которые отделены на расстоянии меньше чем в 200 нм в одно изображение.
Начиная с органоидов клетки вирусы, ДНК и белки, которые представляют интерес для биологов, обычно – меньше чем 200 нм, микроскопия STED преодолевает ограничение легкой дифракции и позволяет визуализацию таких маленьких структур в высоком разрешении.Тем не менее, интенсивность света, требуемая для микроскопии флюоресценции суперрезолюции, намного выше, чем обычная микроскопия, которая приводит к фотоухудшению флуоресцентных молекул краски.
Как пространственное разрешение коррелятов отображения STED с увеличением интенсивности света STED, фотоухудшение флуоресцентных красок становится серьезной проблемой. Представительные фотостойкие флуоресцентные краски, такие как Alexa Fluor® 488 и ATTO 488, как также известно, сталкиваются с фотодеградацией в микроскопии STED, мешая проводить непрерывное живое отображение биологических систем, сохраняя высокое разрешение.Чтобы преодолеть этот выпуск уменьшенной резолюции в отображении STED из-за фотодеградации, команды ITbM во главе с Научными руководителями Шиджехиро Ямэгачи, синтетическим химиком и Тетсуя Хигэшиямой, биолог завода развивал новую флуоресцентную краску, C-Naphox, который увеличил фотостабильность относительно обычных красок. К-Нэфокс продемонстрировал, чтобы не быть чрезвычайно фотостойким с почти никаким ухудшением флюоресценции даже, после того, как продлено отображение STED в живых клетках.
C-Naphox (diarylmethylene-соединенная naphthophosphole P-окись) состоит из ароматической структуры с половиной аминопласта, включенной для ее жертвующих электрон свойств и окиси фосфора для ее принимающих электрон свойств, приводя к интенсивной эмиссии флюоресценции. «Хотя ранее синтезируемые молекулы в группе Ямагучи также привели к высокой интенсивности флюоресценции, это – соединенная углеродом структура в C-Naphox, который является ключом к его чрезвычайно высокому сопротивлению свету высокой интенсивности», говорит Айко Фуказава, адъюнкт-профессор в группе Ямагучи. «Я работал над синтезом молекулярных структур, содержащих определенные элементы с 2006, но это было начиная с начала ITbM в 2013, который мы действительно начали сосредотачивать на синтезировании молекул как флуоресцентные исследования для живого отображения клетки», она продолжает.Вместе с Мэсаясу Таки, адъюнкт-профессором и Чэнуан Ваном, товарищем постдиссертации в группе Ямагучи, они оптимизировали структуру флуоресцентной краски для живого отображения клетки. «C-Naphox и другие производные быстро синтезировались доктором Ваном меньше чем в десяти шагах и, как находили, были стабильны воздухом в течение многих месяцев при комнатной температуре», говорит Фукэзоа. «Кроме того, C-Naphox не показал значительной токсичности к клеткам при микромолярных концентрациях, которые обычно требуются для окрашивания клетки».Фотостабильность недавно синтезируемой краски была доказана экспериментами озарения с ксеноновой лампой. Относительная спектральная поглощательная способность C-Naphox сравнилась со спектральной поглощательной способностью представителя коммерчески доступное отображение STED флуоресцентные исследования, Alexa Fluor® 488 и ATTO 488.
Результаты экспериментов показали, что более чем 99% C-Naphox остались неповрежденными даже после 12 часов озарения, тогда как только 26% Alexa Fluor® 488 остались существующими после 2 часов. Хотя 97% ATTO 488 сохранились после 2 часов озарения существующая сумма была уменьшена до 59% после 12 часов.
Ячейки HeLa были тогда запятнанными или C-Naphox или Alexa Fluor® 488 и выставили повторным условиям отображения STED. Хотя Alexa Fluor®, который запятнанные 488 клетки показали уменьшению в интенсивности сигнала флюоресценции после 5 записей, интенсивности C-Naphox, остался фактически неизменным при тех же самых условиях.«Мы были действительно рады видеть, что C-Naphox показал исключительно высокую фотостабильность за относительно долговременный период», говорят Фукэзоа и Таки. «Лучший момент этой работы был, когда мы видели, что флюоресценция C-Naphox в ячейках HeLa сохранилась и осталась неизменной даже после записи 50 изображений при условиях STED».
Изображения живой клетки были взяты Йошикацу Сато, главным координатором в Живом Центре Отображения ITbM. «Поскольку микроскопия STED – чрезвычайно мощный инструмент, чтобы визуализировать чрезвычайно маленькие структуры, мы надеемся применить эти типы фотостойких молекул, чтобы изучить биологические события, такие как формирование нитей актина в клетках», говорит Таки.«C-Naphox – чрезвычайно фотостойкая флуоресцентная краска, которая позволяет повторенное отображение STED, которое было трудно с обычными красками.
Мы в настоящее время проводим дальнейшие исследования оптимизации, чтобы улучшить практичность C-Naphox как полезное флуоресцентное исследование в непрерывном промежутке времени живая клетка отображение STED и многокрасочное отображение», говорит Фукэзоа.«Наша работа состоит из проектирования молекул, которые содержат элементы, такие как бор, фосфор, кремний и сера в обычной молекулярной структуре углерода, азота и кислорода.
Мы чрезвычайно рады видеть, что наши молекулы развиваются в инструменты, которые полезны для биологических исследований и надеются продолжить работать с биологами, чтобы обнаружить, что новые молекулы и методы с высоким разрешением понимают биологические явления в живущих системах», заявляет Ямагучи.