Новый метод, описанный 2 июля 2015 в журнале Cell, позволяет исследователям наносить на карту критические химические признаки – названный фосфатами – что связь к аминокислотам (стандартные блоки белков) в заключительных этапах создания белка.Когда клетка производит белок, молекулярное синтетическое оборудование сначала соединяет аминокислоты в длинный берег, который сгибается и сворачивается, когда это удлиняет.
Ферменты тогда собираются вокруг структуры, чтобы сделать заключительные изменения – сокращение белка или добавление химических признаков. Среди этих последних модификаций фосфорилирование – или добавление фосфата – отдельных аминокислот, чтобы изменить функцию белка.
До сих пор точное определение точно, где (и почему) все те фосфаты добавлены, было хитро.«Мы знаем, что 9 из этих 20 аминокислот может быть phosphorylated, но мы знаем очень мало о большинстве из них, потому что их настолько трудно изучить», говорит Тони Хантер, американский профессор Противоракового общества, держатель Стула Dulbecco в Молекулярном Солке и Лаборатория Цитобиологии и ведущий автор новой бумаги.Когда фосфат добавлен к трем конкретным аминокислотам – серин, треонин и тирозин – это создает сильную химическую связь. Исследователи могут легко определить местоположение этих фосфатов.
Но когда другие шесть аминокислот – phosphorylated, фосфат только свободно присоединен к каждой аминокислоте, вызывая проблемы для исследователей, пытающихся подбирать то, что происходит в этих случаях. Одна из этих аминокислот, названных гистидином (или phosphohistidine, как только фосфат добавлен), была особенно жесткой, чтобы учиться.«С теми сильными событиями фосфорилирования Вы можете маркировать клетки, одинокие белки и проанализировать белки различными способами узнать, где фосфаты», говорит Хантер. «Вы не можете сделать этого с phosphohistidine, потому что это столь нестабильно, это разваливается, как Вы пытаетесь изолировать белки».Охотник и его сотрудники поняли, что, чтобы изучить это нестабильное взаимодействие, они должны будут использовать уловку, чтобы сделать более сильную связь между фосфатом и гистидином.
Таким образом, они использовали специальный вид измененного фосфата, названного phosphonate, спроектированным, чтобы связать более плотно с любым из двух мест на аминокислоте гистидина, где фосфат может быть добавлен. Затем они развивали антитела, которые определенно признают эти стабильные phosphohistidine аналоги, но также и обнаруживают подлинный phosphohistidine в белках.Чтобы проверить эти новые инструменты, команда добавила их phosphohistidine антитела к коллекции различных клеток млекопитающих, выращенных на слайдах, и наблюдала, где в клетке антитела связали, который указывает на части клеток, у которых есть высокий уровень белков с phosphohistidines.
«Вещь, которая удивила нас больше всего, состоит в том что, когда мы запятнанный клетки с новыми антителами, мы видели дискретные области в клетках, у которых был высокий уровень фосфорилирования гистидина, особенно когда они подвергались mitosis, стадии, на которой клетки делятся на две дочерних клетки», говорит Хантер. Они еще не знают точно, почему то есть, но планируют продолжить исследовать эти результаты, а также обнаруживать фосфорилирование других аминокислот.Команда ожидает, что эти инструменты антитела будут полезны для других лабораторий, стремящихся определить, есть ли у белков интереса какой-либо phosphohistidines.Новый метод «довольно легок для любой лаборатории использовать», говорит Хантер. «Это не требует специального инструмента или чего-либо, таким образом, я думаю, что это может быть справедливо быстро принято».
Другими исследователями на исследовании был Стивен Раш Фахс, Джилл Мейсенхелдер, Аарон Аслэниэн, Ли Ма, Анна Зэгорска и Грег Лемк, Института Солка; Магда Стэнкова, Алан Бинни, Фахад Аль-Обейди и Жак Можер, Sanofi; и Джон Р. Йетс III из Научно-исследовательского института Scripps.Работа и вовлеченные исследователи были поддержаны Национальными Институтами Здоровья, Инновационным Грантом Института Солка и Центром Хелмсли Геномной Медицины.