Яркие видео, произведенные с новой технологией, показывают движение и взаимодействия белков, поскольку клетки реконструируют свои структурные поддержки или реорганизовывают их мембраны, чтобы поднять молекулы снаружи клетки. Лидер группы Janelia Эрик Бециг, постдокторант Дун Ли и их коллеги добавили две новых технологии – оба изменения на SIM – к набору инструментов, доступных для отображения суперрезолюции.
Оптическая микроскопия суперрезолюции производит изображения, пространственное разрешение которых превосходит теоретическое ограничение, наложенное длиной волны света, предлагая экстраординарную визуальную деталь структур в клетках. Но до сих пор, методы суперрезолюции были непрактичны для использования в живых клетках отображения.«Эти методы устанавливают новую норму для того, как далеко Вы можете выдвинуть скорость и неразрушающий из отображения суперрезолюции», говорит Бециг относительно методов свою команду, описанную в 28 августа 2015, выпуск журнала Science. «Это принесет суперразрешение отображения живой клетки для реального».
В традиционном SIM наблюдается образец под линзой, в то время как это освещено образцом света (больше как штрихкод, чем свет от лампы). Применены несколько различных легких образцов, и получающиеся муаровые образцы захвачены от нескольких углов каждый раз цифровым фотоаппаратом. Программное обеспечение тогда извлекает информацию по муаровым изображениям и переводит ее на трехмерную, реконструкцию с высоким разрешением. У заключительной реконструкции есть дважды пространственное разрешение, которое может быть получено с традиционной световой микроскопией.
Betzig был одним из трех ученых, награжденных Нобелевской премией по химии 2014 года за развитие суперрешенной микроскопии флюоресценции. Он говорит, что SIM не получила столько же внимания сколько другие методы суперрезолюции в основном, потому что те другие методы предлагают более драматическую прибыль в пространственном разрешении.
Но он отмечает, что SIM всегда предлагал два преимущества перед альтернативными методами суперрезолюции, включая делаемую светочувствительным микроскопию локализации (ПАЛЬМА), которую он развивал в 2006 с коллегой Janelia Харальдом Гессом.И ПАЛЬМА и стимулируемое истощение эмиссии (STED) микроскопия, другой метод суперрезолюции признал с Нобелевской премией 2014 года, образцами иллюмината с таким большим количеством света, что флуоресцентно маркированные белки исчезают, и образец быстро поврежден, делая продленное отображение невозможным.
SIM, однако, отличается. «Я влюбился в SIM из-за его скорости и того, что он взял настолько менее легкий, чем другие методы», говорит Бециг.Betzig начал работать с SIM вскоре после смерти в 2011 одного из ее пионеров, Матса Густафсона, который был лидером группы в Janelia.
Betzig был уже убежден, что у SIM был потенциал, чтобы произвести значительное понимание внутренних работ клеток, и он подозревал, что улучшение пространственного разрешения техники будет иметь большое значение для увеличения его использования биологами.Густафсон и аспирант Хеспер Рего достигли более высокой резолюции SIM с изменением, названным насыщаемым истощением нелинейный SIM, но тот метод улучшения отраслей пространственного разрешения для более резких условий и потери скорости. Бециг видел путь вокруг того компромисса.Влажное истощение увеличивает разрешение изображений SIM, используя в своих интересах флуоресцентные этикетки белка, которые могут быть включены и выключены со светом.
Чтобы произвести изображение, все флуоресцентные этикетки в белке включены, затем волна света используется, чтобы дезактивировать большинство из них. После воздействия легкой дезактивации, только молекулы в самых темных областях световой волны продолжают флюоресцировать. Они предоставляют более высокую информацию о частоте и обостряют получающееся изображение.
Изображение захвачено, и цикл повторен 25 раз или больше произвести данные для заключительного изображения. Принцип очень похож на путь суперрезолюция в достигнутом в STED или связанном методе под названием RESOLFT, говорит Бециг.Метод не подходит жить отображение, он говорит, потому что занимает слишком много времени включать и выключать photoactivatable молекулы.
Кроме того, повторное воздействие света повреждает клетки и их флуоресцентные этикетки. «Проблема с этим подходом состоит в том, что Вы сначала включаете все молекулы, тогда Вы немедленно выключаете почти все молекулы. Молекулы, которые Вы выключили, ничего не вносят в изображение, но Вы только что пожарили их дважды. Вы подчеркиваете молекулы, и требуется много времени, которое Вы не имеете, потому что клетка перемещается».Решение было просто, Бециг говорит: «Не включайте все молекулы.
Нет никакой потребности сделать это». Вместо этого новый метод, названный шаблонной фотоактивацией нелинейный SIM, начинается, включая просто подмножество флуоресцентных этикеток в образце с образцом света. «Копирование этого уже дает Вам некоторую информацию о высоком разрешении», объясняет он. Новый образец света используется, чтобы дезактивировать молекулы, и дополнительная информация прочитана из их дезактивации. Совместное воздействие тех образцов приводит к заключительным изображениям с резолюцией на 62 миллимикрона – лучше, чем стандартный SIM и трехкратное улучшение по сравнению с ограничениями, наложенными длиной волны света.
«Мы можем сделать это, и мы можем сделать это быстро», говорит он. Это важно, он говорит, потому что для динамических процессов отображения, увеличение пространственного разрешения бессмысленно без соответствующего увеличения скорости. «Если что-то в клетке перемещается в микрон в секунду, и у меня есть резолюция на один микрон, я могу взять то изображение через секунду.
Но если у меня есть 1/10-micron резолюция, я должен взять данные через одну десятую секунды, или иначе это намажет», объясняет он.Нелинейный SIM шаблонной фотоактивации захватывает 25 изображений, которые входят в заключительную реконструкцию в приблизительно одной трети секунды. Поскольку это делает так эффективно, используя низкий свет интенсивности и подбирая информацию из каждого фотона, испускаемого от флуоресцентных этикеток образца, этикетки сохранены так, чтобы микроскоп мог изображение дольше, позволяя ученым наблюдать, что больше действия разворачивается.
Команда использовала скопированную фотоактивацию нелинейный SIM, чтобы произвести видео, показывающие, что структурные белки ломаются и повторно собирают себя, когда клетки перемещают и изменяют форму, а также динамику крошечных ям на поверхности клеток, названной caveolae.Команда Бецига также сообщает в научной работе, что они могут повысить пространственное разрешение SIM к 84 миллимикронам отображением с коммерчески доступной целью микроскопа с ультравысокой числовой апертурой. Апертура ограничивает воздействие света очень небольшой частью образца, ограничивая повреждение клеток и флуоресцентных молекул, и метод может привыкнуть к изображению многократные цвета в то же время, таким образом, ученые могут одновременно отследить несколько различных белков.Используя высокий числовой подход апертуры, команда Бецига смогла следить за движениями и взаимодействиями нескольких структурных белков во время формирования центрального прилипания, физических связей между интерьером и внешностью клетки.
Они также следовали за ростом и интернализацией покрытых клатрином ям, структуры, которые облегчают потребление молекул от за пределами клетки. Их количественный анализ ответил на несколько вопросов о распределении ям и отношениях между размером ям и продолжительностью жизни, которая не могла быть обращена с предыдущими методами отображения.Наконец, объединяя высокий подход числовой апертуры с шаблонным photoactivatable нелинейным SIM, Betzig и его коллеги могли следовать за двумя белками за один раз с более высокой резолюцией, чем высокий числовой подход апертуры, предлагаемый самостоятельно.Команда Бецига продолжает разрабатывать их технологии SIM и говорить, что дальнейшее совершенствование вероятно.
Они также стремятся работать с биологами, чтобы продолжить исследовать возможное применение и совершенствовать удобство использования их методов.На данный момент ученые, которые хотят экспериментировать с новыми методами SIM, могут договориться сделать так через Продвинутый Центр Отображения Джейнлии, который обеспечивает доступ к ультрасовременной технологии микроскопии бесплатно.
В конечном счете Бециг говорит, это должно быть довольно прямо, чтобы сделать технологии SIM доступными и доступными другим лабораториям. «Большая часть волшебства находится в программном обеспечении, не аппаратных средствах», говорит он.