CRISPR-Cas9 – исключительный инструмент, но технология не прекрасна. Когда используется, это иногда производит вставки и удаления, известные как indels, на непреднамеренных нецелевых местах.
Так как непреднамеренный генный раскол мог привести к неожиданной мутации, крайне важно обнаружить любые ошибки в процессе CRISPR-Cas9. 19-го января в Исследовании Генома, команда Кима в IBS представила инструмент, который они назвали мультиплексным Digenome-seq (переваренный упорядочивающий геном), который может планировать специфики всего генома нескольких нуклеаз CRISPR-Cas9 одновременно, чтобы найти и намеренный и нежелательный indels быстро и дешево.
Первый автор Дэезик Ким объясняет, что «Digenome-seq отличается от других основанных на клетке методов, в которых он обнаруживает расколы ДНК в пробирке, а не в клетках, используя геномную ДНК без клеток». Преимущество использования ДНК без клеток состоит в том, что это приводит к точным аналитическим результатам, потому что хроматин, который обычно находится в клетке, не вмешивается в процесс. Кроме того, потому что рассматриваемая ДНК не должна быть усилена, в массе используя PCR перед расследованием; Digenome-seq легче, быстрее и более дешевый, чтобы использовать, чем предыдущие методы. Digenome-seq работает, объединяя целевую ДНК без клеток с белком Cas9 и sgRNA (единственная РНК руководства) в пробирке. sgRNA приводит Cas9 на целевое и нецелевое место на ДНК, где это расколото эндонуклеазой Cas9.
В исследовании исследователи определили на – и нецелевые места, расколотые в пробирке, и измерили indel частоты на сотнях нецелевых мест в клетках, которые могли потенциально стать непреднамеренными мутациями. Их точность тогда выиграна, используя систему, которую разработала команда IBS, назвал OTI (нецелевой индекс эффекта), который сравнивает отношение нецелевых к частотам на цели.
В отличие от ранее используемых процессов monoplex, которые могут только работать с одним sgRNA за один раз, мультиплексный Digenome-seq выполняет одновременный анализ многочисленного sgRNAs, чтобы обнаружить все их и нецелевые места на цели одновременно. Этот мультиплексный процесс быстрее, более эффективен и более экономически выгоден, чем предыдущие методы. В дополнение к его скорости Digenome-seq в состоянии обнаружить больше нецелевого indels, чем другие методы как HTGTS или Руководство-seq.
Директор IBS Чжин-Су Ким заявил, что «CRISPR-Cas9 – невероятный научный прорыв и продолжит быть центром исследования биологов во всем мире». Он добавил, что «Эта техника может использоваться, чтобы выбрать целевые места с наименьшим количеством нецелевых эффектов, метод, важный для терапевтических применений CRISPR-Cas9».
С превосходящей точностью, снижением расходов и скоростью, мультиплексный Digenome-Seq, кажется, новый стандарт для тестирования специфики CRISPR-Cas9.