Система CRISPR/Cas9 предназначается для определенных последовательностей ДНК и вызывает чистые сокращения через оба берега ДНК. В клетках млекопитающих такие сокращения сигнализируются и быстро восстанавливаются чрезвычайной системой ремонта под названием NHEJ (для несоответственного присоединения конца). NHEJ эффективен, но не очень точен и часто приводит к вставке или удалению нескольких оснований ДНК на месте ремонта.
Поскольку ДНК прочитана в кодонах трех оснований за один раз, такие небольшие изменения в критических положениях часто разрушают функцию соответствующего гена и его продукта белка.Роберт Ян Леббинк, из Университетского Медицинского центра в Утрехте, Нидерланды и коллегах рассуждал, что CRISPR/Cas9 мог предназначаться и видоизменить скрытую ДНК вируса герпеса в зараженных клетках человека и так потенциально предотвратить сопутствующие заболевания вируса герпеса. Чтобы проверить это, исследователи разработали определенное руководство (g) РНК – последовательности, которые дополнительны к жизненно важным частям вирусного генома и функции как ‘молекулярные адреса’.
Эти gRNAs, объединенные с ‘молекулярными ножницами’ часть системы CRISPR/Cas9, должны вызвать определенные сокращения и последующие мутации в ДНК вируса герпеса, и так нанесите вред вирусам.В их систематическом подходе исследователи посмотрели на трех различных членов группы вируса герпеса: вирусный тип 1 (HSV-1) герпеса простого, вызывающий герпес и кератит герпеса; человеческий цитомегаловирус (HCMV), наиболее распространенная вирусная причина врожденных дефектов (когда вирус передан от матери к зародышу); и Вирус Эпштейновского Барристера (EBV), вызывающий инфекционный мононуклеоз и многократные типы рака.
Работая с клетками лимфомы, скрытым образом зараженными EBV, исследователи показали, что введение gRNAs, которые предназначаются для определенных последовательностей ДНК EBV, может ввести мутации на целевых местах. Такие мутации могут устранить существенные функции вируса, а также дестабилизировать вирусные Молекулы ДНК. В соответствии с этим, исследователи сообщают, что при помощи двух различных gRNAs планирование для существенного гена EBV, они могут вызвать потерю более чем 95% геномов EBV от клеток – хозяев.
Во время скрытой инфекции геномы HCMV существуют как круглые Молекулы ДНК в ядре клеток – хозяев. После вирусного оживления повторение HCMV медленно продолжается.
С соответствующим gRNAs исследователи нашли, что редактирование CRISPR/Cas9 может эффективно ослабить повторение HCMV. Однако они также наблюдали появление вариантов спасения, которые обходят редактирование CRISPR/Cas9, предполагая, что одновременное редактирование на многократных критических местах в геноме HCMV необходимо, чтобы избежать развития стойких геномов.
По сравнению с HCMV HSV-1 умножается намного быстрее. Когда исследователи проверили различный gRNAs планирование для различных существенных генов HSV-1 вместе с CRISPR/Cas9, они нашли, что многие из них смогли уменьшить вирусное повторение. Когда они объединили два из тех gRNAs, таким образом одновременно будучи нацелен на два существенных гена, они смогли полностью подавить повторение HSV-1.
С другой стороны, они были неспособны вызвать редактирование во время скрытой фазы, т.е. когда вирусная ДНК активно не умножалась.«Мы наблюдали очень эффективное и определенное разрешение EBV от скрытым образом зараженных опухолевых клеток и нарушения HSV-1 и повторения HCMV в клетках человека», исследователи подводят итог. Они продолжают, «хотя CRISPR/Cas9 был неэффективен при направлении разработки генома неподвижного HSV-1, вирусное повторение после оживления неподвижного HSV-1 было эффективно аннулировано, используя anti-HSV-1 gRNAs».
Их результаты, они надеются, «может позволить дизайн эффективных терапевтических стратегий предназначаться для человеческих вирусов герпеса и во время скрытых и во время продуктивных инфекций».